（德國IBL：RE59131）
1、應(yīng)用范圍
此ELISA試劑盒可用于人尿液中5-HIAA的體外定量檢測。
2、前言
3、實(shí)驗(yàn)原理
此ELISA試劑盒利用的是競爭法原理，生物素標(biāo)記抗原和未用生物素標(biāo)記抗原競爭結(jié)合一定量的抗體結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合到抗體上生物素標(biāo)記抗原的量與樣品中被分析物的濃度成反比。反應(yīng)系統(tǒng)達(dá)到平衡后，未結(jié)合的生物素標(biāo)記的抗原用洗滌液洗去。結(jié)合了生物素標(biāo)記抗原的抗體的量的測定是以抗生物素堿性磷酸酶作為標(biāo)記物，以PNPP（對硝基苯酚磷酸鹽）作為底物液。將未知物的酶反應(yīng)活性和已知標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)曲線相比較，可以得到未知物的量。
| 數(shù)量 | 標(biāo)志 | 成分 |
| 1×12×8 | MTP | 包被板，可拆，微孔中包被了抗兔IgG（羊，單克隆）。 |
| 1×5ml | ANTISERUM | 5-HIAA 抗血清 藍(lán)色，即用，內(nèi)含：抗血清（兔），磷酸緩沖液，穩(wěn)定劑。 |
| 1×5ml | BIOTIN | 5-HIAA 生物素 即用，藍(lán)色，內(nèi)含：磷酸緩沖液，穩(wěn)定劑。 |
| 1×0.2mL | ENZCONJ CONC | 酶聯(lián)物濃縮型（100×） 內(nèi)含：堿性磷酸酶標(biāo)記的抗生物素抗體（羊），Tris緩沖液，穩(wěn)定劑 |
| 1×7×0.5ml | CAL A-G | 標(biāo)準(zhǔn)品A-G 0; 0.4; 1.0; 2.75; 7.5; 20; 55 mg/L 0; 2.1; 5.25; 14.4; 39.4; 105; 288 μmol/L 即用,內(nèi)含:5-HIAA（甲基化）,穩(wěn)定劑。 |
| 1×2×0.5ml | CONTROL 1+2 LYO | 質(zhì)控品1+2，凍干粉，內(nèi)含：人尿液（正常與非正常人的尿液），具體濃度及可允許范圍請見試劑瓶標(biāo)簽. |
| 1×2ml | METHYLRAGE | 甲基化試劑，黃色，即用，內(nèi)含二氯甲烷 |
| 1 x 1 mL | HCL | HCl，即用，0.1M的HCl |
| 1 x50ml | ASSAUBUF CONC | 檢測緩沖液，濃縮（10 x） 內(nèi)含：磷酸緩沖液，BSA，穩(wěn)定劑 |
| 1 x4ml | DILREAG | 稀釋液，即用，內(nèi)含：N,N-二甲基甲酰氨 |
| 1 x50ml | WAHSBUF CONC | 洗滌液，濃縮（20 x） 內(nèi)含：磷酸緩沖液，吐溫，穩(wěn)定劑 |
| 1×9 | PNPP SUBS | PNPP底物片，內(nèi)含：對硝基苯磷酸（PNPP） |
| 1×27ml | PNPP BUF | PNPP底物緩沖液，即用，內(nèi)含：二乙醇胺，水， |
| 1×15ml | PNPP STOP | PNPP終止液，即用，內(nèi)含：1M的NaOH，0.25M的EDTA |
| 3× | FOIL | 粘性金屬板 |
1）移液器（20；25；50；100；1000μL）
2）玻璃檢測用試管（12×75mm）
3）旋渦混合器
4）帶儲器的8通道移液器
5）洗滌瓶，自動或半自動包被板清洗系統(tǒng)
6）酶標(biāo)儀
7）雙蒸水或去離子水
8）通風(fēng)櫥
9）吸水紙，取樣吸頭，計(jì)時器
| 注意 | 此96人份的檢測試劑可分成3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。下列體積為用四條包被板（32人份）進(jìn)行一次檢測所需要的試劑的量。如果客戶想將標(biāo)準(zhǔn)品的量由7個減為6個，您可去掉標(biāo)準(zhǔn)品G。則實(shí)驗(yàn)結(jié)果的報告范圍相應(yīng)的減少到3000μg/L |
| 稀釋 | 成分 | | 稀釋液 | 比例 | 備注 | 貯存 | 穩(wěn)定性 |
| 15ml | 檢測緩沖液 | 150ml | 雙蒸水 | 1；10 | 充分混合 | 2-8℃ | 2周 |
| | 炙控品 | 0.5ml | 0.1M的HCl | | 靜置15min，混合時避免氣泡 | ≤-20℃ | 8周 |
| 15ml | 洗滌液 | 300ml | 雙蒸水 | 1：20 | 加熱至37℃以溶解所有的晶體（如果有必要），充分溶解。 | 2-8℃ | 4周 |
| 60μL | 酶聯(lián)物 | 60ml | 檢測緩沖液（已稀釋好） | 1：101 | 臨時配置，僅能使用一次，混合時避免氣泡產(chǎn)生 | 18-25℃ | 30min |
| 3 | PNPP底物片 | 8ml | PNPP底物液緩沖液 | | 臨時配置，僅能使用一次,混合時必免氣泡產(chǎn)生 | 18-25℃ | 10min |
| 注意 | 不要甲基化標(biāo)準(zhǔn)品，它已經(jīng)被甲基化了。 |
| 1） | 將質(zhì)控品和樣品分別20μL加入到相應(yīng)的玻璃試管中。 |
| 2） | 完成次操作步驟后，請?jiān)谕L(fēng)櫥內(nèi)繼續(xù)操作。 |
| 3） | 在每一支試管中加入50μL稀釋液。旋渦混合器上混合。 |
| 4） | 在每一試管中加入25μL甲基化試劑。加入試劑后立即混合試管內(nèi)溶液。注意：反應(yīng)混合物的黃顏色應(yīng)當(dāng)持續(xù)穩(wěn)定，如果顏色迅速消失說明樣品中酸的量過大。在這種情況下在向試管中加20μL甲基化試劑。 |
| 5） | 蓋好試管，室溫（18-25℃）下溫育20min |
| 6） | 在每一試管中加入5ml已稀釋好的檢測緩沖液。用塞子蓋好是試管并旋轉(zhuǎn)幾次。手動或用混合器上下混合zui少五次，以便液體能充分混合。 |
| 7） | 完成此步驟后就可以不要才通風(fēng)櫥下操作了。 |
| 8） | 吸取50μL上清液，立即進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。上清液室溫下可穩(wěn)定存放1h。 |
| 1） | 將標(biāo)準(zhǔn)品、甲基化質(zhì)控品和甲基化病人樣品分別50μL加入到相應(yīng)的微孔。 |
| 2） | 在每一微孔中加入50μL 5-HIAA生物素。 |
| 3） | 在每一微孔中加入50μL 5-HIAA抗血清。 |
| 4） | 蓋板，小心振動包被板。2-8℃下溫育一夜（16-20h）。 |
| 1） | 移去金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，用250μL洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干。 |
| 2） | 每孔加入150μL臨時配置好的酶聯(lián)物 |
| 3） | 用一新的粘性金屬蓋板。室溫環(huán)境（18-25℃）下，在軌道搖床（500rpm）上溫育120min. |
| 4） | 在溫育結(jié)屬前大約10min的樣子時，向微孔中加入酶聯(lián)物。 |
| 5） | 移去金屬板，棄去孔內(nèi)反應(yīng)液，用250μL已稀釋好的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干。 |
| 6） | 在加入底物液和終止液時，如果有條件的話，可使用8道移液器進(jìn)行加液。加底物液和終止液必須按相同的時間間隔進(jìn)行，避免氣泡產(chǎn)生。 |
| 7） | 在每一微孔中加入200μL臨時配置好的PNPP底物液。 |
| 8） | 室溫（18-25℃）環(huán)境下，在軌道搖床上溫育60min。 |
| 9） | 在每一微孔中加入50μL PNPP終止液以終止反應(yīng)。輕輕搖動包被板以混合各種成分。 |
| 10） | 加入終止液后60min之內(nèi)在405nm處測OD值（參考波長：600-650nm）。 |
| | | |||
| mg/24h | μmol/天 | |||
| 5-HIAA | 6～10 | 31.5～52.5 | ||
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